血清實驗室檢測協(xié)議書 梅毒實驗室血清檢測金標(biāo)準(zhǔn)(二篇)

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血清實驗室檢測協(xié)議書(推薦)一

流感病毒顆粒表面的血凝素（ha）蛋白，具有識別并吸附于紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)，ha試驗由此得名。ha蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾ha蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

該試驗是目前who進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法。可用于流感病毒分離株ha亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。

只有當(dāng)抗原和抗體ha亞型相一致時才能出現(xiàn)hi現(xiàn)象，各亞型間無明顯交叉反應(yīng)；除雞血清以外，用雞紅細(xì)胞檢測哺乳動物和水禽的血清時需要除去存在于血清中的非特異凝集素；需要在每次試驗時進(jìn)行抗原標(biāo)準(zhǔn)化；需要正確判讀的技能。

1 ?阿氏（alsevers）液配制

稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100ml，散熱溶解后調(diào)ph值至6.1，

69kpa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。?.8%枸櫞酸鈉（3.8g枸櫞酸鈉，100ml超純水），101 kpa,20min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?保存期1個月）。

2 ?10%和1%雞紅細(xì)胞液的制備

2.1采血

用注射器吸取阿氏液約1ml（3.8%枸櫞酸鈉），取至少2只spf雞（如果沒有spf雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4ml，與阿氏液混合（3.8%枸櫞酸鈉），放入裝10ml阿氏液（生理鹽水）的離心管中混勻。

2.2 洗滌雞紅細(xì)胞

將離心管中的血液經(jīng)1500～1800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液（生理鹽水），輕輕混合，再經(jīng)1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，加入阿氏液20 ml（生理鹽水），輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，不超過5天。

2.3 ?10%雞紅細(xì)胞懸液

取阿氏液保存不超過5天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(ml)，加入9倍體積(ml)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。（此步

可省略，直接配制1%紅細(xì)胞）

2.4 ?1%雞紅細(xì)胞液

取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1 ml，加入9 ml生理鹽水，混合均勻即可。（根據(jù)檢測血清的數(shù)量，估算一下需要的1%雞紅細(xì)胞量，可按0.3ml/每份血清）

3 抗原血凝效價測定（ha試驗，微量法）

3.1 在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入25μl pbs（生理鹽水），換滴頭。

3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混勻。

3.3從第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混勻后吸取25μl加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μl棄之，換滴頭。

3.4每孔再加入25μl pbs（生理鹽水）。

3.5每孔均加入25μl 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。

3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1小時）。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。

3.7結(jié)果判定 ?將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果。

能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（hau）。注意對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效。

4 血凝抑制（hi）試驗（微量法）

4.1 根據(jù)3的試驗結(jié)果配制4hau的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4hau的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4hau抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。

4.2 在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入25μl pbs（生理鹽水），第12孔加入50μl pbs（生理鹽水）。

4.3 吸取25μl血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25μl于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μl棄去。

4.4 1孔～11孔均加入含4hau抗原25μl，室溫（約20℃）靜置至少30min。

4.5 每孔加入25μl 1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行），對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。

4.6 結(jié)果判定

試驗成立的條件：只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。

以完全抑制4hau抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為hi滴度。

hi價小于或等于31og2判定hi試驗陰性；hi價大于或等于41og2為陽性。

1、合理選擇抗原和對照陽性血清。針對re-4和re-5株疫苗免疫采用相應(yīng)抗原和對照陽性血清。

同一亞型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株來源不同，則可能會存在抗原性差異，從而使檢測同一血清的結(jié)果有差別。一般來講，疫苗種毒株如果與抗原所用毒株相同時，則所測得的hi效價較高。

2、合理使用和保存抗原。反應(yīng)試劑要按規(guī)定保存和使用，凍干的試劑應(yīng)按照說明中規(guī)定的體積重新溶解并保存。要避免雜菌污染，因為污染所造成的非流感起源的凝集素也可與所有抗血清發(fā)生非特異反應(yīng)。為避免反復(fù)凍融和細(xì)菌污染，可以無菌操作將試劑分裝成小包裝。

3、反應(yīng)溫度不能太高。若在37℃ （如溫箱）下進(jìn)行，

血清實驗室檢測協(xié)議書(推薦)二

隨著養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展和廣大養(yǎng)殖戶科學(xué)意識的不斷提高，人們普遍認(rèn)識到實驗室檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用的重要性。下面簡單介紹一下雞新城疫微量血凝試驗和血凝抑制試驗的注意事項及操作方法。

用于新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征和傳梁性支氣管炎等的母源抗體的檢測、雛雞首免日齡的確定、疫苗免疫后的免疫應(yīng)答的監(jiān)測、臨床雞病的鑒別診斷等。

下面以新城疫病毒為例，介紹血凝和血凝抑制試驗的方法：

一、樣本要具有代表性：所采樣本要能代表整體，通常采用四角加中間的隨機取樣法，并且確定適當(dāng)?shù)臉悠窋?shù)量，一般1000只以下的雞群采樣率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。對產(chǎn)蛋期間的雞群可采雞蛋；對雛雞或青年雞，可采血。方法是：取青霉素小瓶，洗凈后用蒸餾水沖洗、控干水分，并注意不要用消毒劑，以免影響結(jié)果。每只雞采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室溫下靜置至血清自然析出。

二、四單位抗原的準(zhǔn)確性：要獲得準(zhǔn)確的監(jiān)測效果，先做紅血球的凝集試驗，即測得抗原的血凝價，爾后前移2孔作為四單位抗原的稀釋度。

三、紅血球洗脫的充分性：原則上，新城疫檢測所用的紅血球應(yīng)來源于非疫苗免疫過的健康公雞，但實際上卻多采用免疫過疫苗的健康公雞，有時甚至是病雞。因此，對紅血球的洗脫的次數(shù)要多、要充分，并注意轉(zhuǎn)速和時間，通常采用五次變速離心法：前四次為每分鐘1500轉(zhuǎn)，每次5分鐘，最后一次為每分鐘3000轉(zhuǎn)，持續(xù)7～8分鐘。另外，洗紅血球過程中，應(yīng)注意動作要輕，玻璃儀器之間盡量減少碰撞，以免造成紅血球破裂而影響結(jié)果。

四、結(jié)果判定的及時性：檢測中，每次試驗均應(yīng)設(shè)抗原與生理鹽水對照，加入紅血球后，每隔5分鐘觀察一次，一旦兩列對照孔圖像清晰地顯示出來時，應(yīng)立即對樣本進(jìn)行結(jié)果判定，過早過晚都會影響判定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、材料與儀器：新城疫抗原、1%雞紅血球、抗凝劑、生理鹽水、被檢血清、離心機、吸管、滴管、洗耳球、燒杯、量筒、注射器、長針頭、96孔v型醫(yī)用血凝板、微量移液器、微量振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱等。

二、方法：

1%雞紅血球的制備：

1.用長針刺入雞心臟或翅下靜脈，采血，采血量視用量而定，5%抗凝劑與全血的比例為1∶3～4。

2.洗血球：共洗4～5次，每次5～8分鐘，紅血球與生理鹽水的比例至少為1∶2～3。離心機轉(zhuǎn)速為每分鐘1500～3000轉(zhuǎn)，最后傾去上清。

3.吸紅血球泥1ml加生理鹽水99ml，配成1%紅血球備用。

三、血凝試驗：

1.血凝板上12個孔內(nèi)全部加入生理鹽水，每孔0.05ml，吸等量新城疫抗原于第一孔內(nèi)，混勻后吸出同量于第二孔內(nèi)混勻，以此類推稀釋至第11孔，并棄去0.05ml，留第12孔作為生理鹽水對照，然后全部孔內(nèi)加入1%雞紅血球。

2.將血凝板置于振蕩器上振蕩1～2分鐘，使材料充分混均，放入恒溫培養(yǎng)箱，每5分鐘觀察一次，至10～15分鐘取出，一般以生理鹽水對照孔的圖象清析地出現(xiàn)為準(zhǔn)。

3.結(jié)果判定：紅血球在反應(yīng)板底部全部均勻鋪開為完全凝集（++++），在血凝板底部集為一小紅點為沉淀（－），如底部為一小紅點，四周為凝集的紅細(xì)胞，則為不完全凝集（++）。

4.出現(xiàn)完全凝集的抗原的最高稀釋度，即為該抗原的凝集價。

5.四單位抗原的制備：血凝試驗的結(jié)果如為28（256），則前移2孔即26（64），作為四單位抗原的稀釋度。即：63ml生理鹽水+1ml抗原即為四單位抗原。

四.血凝抑制試驗：

1.血凝板上1～11孔全部加入0.05ml的生理鹽水，于第一孔內(nèi)加入等量的被檢抗體，稀釋至第10孔，棄去0.05ml，再加入等量的4單位新城疫抗原至第11孔，第11孔為抗原對照，12孔為生理鹽水對照。在振蕩器上振蕩1～2分鐘，放置室溫約20分鐘，然后加入等量的1%雞紅血球，振蕩后放入恒溫培養(yǎng)箱大約10～15分鐘后進(jìn)行結(jié)果判定。

2.結(jié)果：能完全抑制紅細(xì)胞凝集的被檢抗體的最高稀釋度為該被檢抗體的血凝抑制滴度。

注：1、hi價在23～24時免疫可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，如在疫區(qū)可提高到24～25免疫。

2、24～25hi210時為最好。3、如hi價高于211則為強毒污染。

注：#為完全抑制，++為不完全抑制，－為不抑制。